MeiraGTx Holdings plc ha anunciado que la empresa expondrá ocho pósters y realizará una presentación oral en el Congreso Anual 2023 de la Sociedad Europea de Terapia Génica y Celular (ESGCT), que se celebrará del 24 al 27 de octubre de 2023 en Bruselas, Bélgica. Póster nº 122: Desarrollo de alternativas a la lisis celular con Tritón X-100 para la recuperación primaria de AAV2, AAV5 y AAV8; Categoría: AAV y vectores no integrativos; El Tritón X-100 es un detergente eficaz para recuperar productos biológicos de compartimentos intracelulares, pero su uso está prohibido actualmente por la normativa de Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas (REACH), ya que su degradación genera un compuesto que afecta negativamente a la vida acuática. El objetivo de este trabajo era desarrollar métodos alternativos al Tritón X-100 para la recuperación del virus adeno-asociado (AAV) a partir de células 293 de riñón embrionario humano que cumplieran la normativa REACH, fueran compatibles con las Buenas Prácticas de Fabricación, no afectaran a la calidad del producto y mostraran una recuperación del producto comparable en relación con la lisis con Tritón X-100.

Se evaluaron dos métodos alternativos de liberación de AAV para los serotipos AAV2, AAV5 y AAV8: 1) Se probó inicialmente un método de liberación hiperosmótica sin detergente a escala de microplaca utilizando un enfoque de Diseño Central Compuesto de Experimentos, antes de escalar a escala de reactor de tanque agitado (STR) de 250 mL. 2) Cuando no resultó adecuado, se evaluó un método de lisis utilizando el detergente Deviron C16 a escala de 250 mL de STR con concentraciones que oscilaban entre el 0,1 y el 0,5%. Por último, las condiciones satisfactorias para cualquiera de los dos métodos se escalaron a escala STR de 10 L.

Para el serotipo AAV8, un método hiperosmótico de liberación de AAV empleó la adición de 400 mM de NaCl y la incubación durante 2 horas, lo que condujo a una recuperación de ~70% de VG en relación con el método heredado de Triton X-100. Para los serotipos AAV2 y AAV5, un método de lisis Deviron C16 al 0,5% resultó ser el más adecuado, dando lugar a recuperaciones de VG del 87% y el 97% en relación con la liberación de AAV con Triton X-100, respectivamente. No se necesitaron cambios en el proceso posterior para acomodar estos métodos alternativos.

Además, ambos métodos eran escalables a escala STR de 10 L, y las impurezas relacionadas con el proceso, incluidos el ADN residual y las proteínas de la célula huésped, así como la potencia del producto, no se vieron afectadas por estos métodos. En conclusión, este estudio demuestra dos métodos alternativos optimizados de liberación de AAV para sustituir el uso de Triton X-100 que mostraron perfiles comparables de recuperación del producto y de calidad del producto. Póster nº 167: Desarrollo de líneas celulares de ensayo de potencia para vectores de terapia génica ocular; Categoría: AAV y vectores no integradores; Cuando se producen productos farmacéuticos AAV GMP, la capacidad de evaluar su potencia es una parte esencial de la liberación y la estabilidad.

Los ensayos de potencia basados en células son un requisito normativo para la comercialización de las terapias génicas con AAV, pero la escasa transducibilidad in vitro de los AAV, así como la incapacidad de comprobar la expresión debido al uso de promotores específicos de tejido, dificultan el desarrollo de ensayos eficaces y robustos. Del mismo modo, la investigación preclínica básica, en la que son deseables ensayos fáciles de implementar para realizar experimentos e iteraciones a un ritmo más rápido, adolece de las mismas limitaciones. Por ello, la empresa se propuso examinar formas de aumentar la transducibilidad del vector, así como de establecer la transactivación del promotor ocular en las líneas celulares más utilizadas (HEK293 y HeLa).

La empresa evaluó diferentes métodos para aumentar la transducibilidad de los vectores AAV5 y AAV8, así como para transactivar los promotores específicos de los fotorreceptores (rodopsina quinasa) y del EPR (RPE65). En experimentos de rango de dosis, se identificaron potentes transactivadores mediados por dCas9 para ambos promotores y se estableció la suplementación con factores exógenos que aumentaron la transducibilidad de ambas cápsides varias veces por encima del valor de referencia. Estudios posteriores permitirán combinarlos en una plataforma de ensayo de potencia in vitro basada en células para la liberación de lotes GMP y pruebas de estabilidad.

Póster nº 324: Utilización de la modelización mecanística para diseñar un proceso de plataforma para la separación de cápsides de AAV llenas y vacías; Categoría: Fabricación Los virus adenoasociados son relativamente nuevos en el campo de las modalidades biofarmacéuticas y se utilizan para administrar un gen terapéutico a un paciente. Durante su producción previa, se utilizan procesos celulares separados para producir la cápside viral y el transgén terapéutico, y empaquetar el transgén dentro de la cápside. Esto conduce a la expresión de cápsides vacías que deben eliminarse durante el proceso posterior, ya que pueden estimular una respuesta inmunitaria en el paciente.

La separación de las cápsidas vacías supone un reto debido a la similitud de propiedades entre las cápsidas vacías y las cápsidas completas. La proporción de cápsides vacías puede variar ampliamente y llegar hasta el 90% dependiendo de la madurez del proceso anterior, lo que puede aumentar aún más el reto de lograr esta separación. La mayoría de los intentos se han centrado en utilizar la cromatografía de intercambio aniónico para aprovechar la diferencia de carga y lograr esta separación.

Sin embargo, existe una gran diversidad en los enfoques publicados, ya que algunos grupos utilizan diferentes tipos de matriz (resinas, membranas y monolitos), condiciones de proceso y aditivos. Company ha demostrado previamente que la partición débil puede utilizarse para maximizar el enriquecimiento de cápsides completas, lo que aumenta aún más las opciones disponibles para esta separación. El establecimiento de un proceso de plataforma suele implicar el cribado de una serie de opciones al tiempo que se utiliza la heurística para acotar el espacio de diseño y reducir la carga experimental.

Esto suele conducir a que las opciones de proceso se comparen en condiciones subóptimas y existe el riesgo de que no se identifique la plataforma óptima. Esta presentación se centrará en el trabajo realizado para demostrar que los modelos mecanísticos pueden utilizarse para identificar un proceso de plataforma óptimo para el enriquecimiento de cápsides completas de AAV2. En este estudio, se desarrollaron modelos mecanísticos para la separación de cápsides completas y vacías de AAV2 para tres matrices AEX que se habían mostrado prometedoras previamente durante la evaluación experimental.

A continuación, se utilizaron estos modelos para examinar una serie de condiciones de proceso (concentraciones de sal, relaciones de carga) y los modos de funcionamiento (ligar y eluir, flujo continuo, partición débil) e identificar las condiciones óptimas para cada matriz. Por último, se verificaron experimentalmente las condiciones óptimas identificadas.